ΦΛΑΒΟΝΟΕΙΔΗ



Γενικά
Τα φλαβονοειδή αποτελούν μία μεγάλη ομάδα πολυφαινολικών ενώσεων χρωστικών που βρίσκονται σε όλα σχεδόν τα φυτά και αποτελούν τα δραστικά συστατικά πολλών φαρμάκων φυτικής προέλευσης. Παρουσιάζουν πλήθος βιολογικών ιδιοτήτων, συμπεριλαμβανομένης της αντικαρκινικής, αντιοξειδωτικής, αντιφλεγμονώδους, αντιβακτηριακής, αντιαλλεργικής και αντιϊικής [5,6].
Χρησιμοποιούνται ως συστατικά τροφίμων και καλλυντικών. Στα ανώτερα φυτά, απαντώνται υπό μορφή γεννινών ή γλυκοσιδών. Οι φλαβονόλες, για παράδειγμα, βρίσκονται κυρίως ως 3-O-γλυκοσίδες, ενώ οι 7- και 4΄-θέσεις μπορούν να γλυκοσιλιωθούν, όπως συμβαίνει στα κρεμμύδια. ?λλες κατηγορίες φλαβονοειδών όπως οι φλαβόνες, φλαβανόνες και ισοφλαβόνες, είναι κυρίως γλυκοσιλιωμένες στην 7-θέση (Σχήμα 1).

Φυτικής προέλευσης γλυκοζίτες φλαβονοειδών και ανθοκυανίνες απαντώνται συχνά σε ακυλιωμένη μορφή με αρωματικά οξέα όπως το π-κουμαρικό οξύ και το καφεϊκό οξύ σε μια συγκεκριμένη υδροξυ-ομάδα του σακχαρικού μέρους τους. Οι ενώσεις αυτές είναι σταθερές στους φυτικούς ιστούς εξαιτίας δια- και ενδομοριακών υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων που προκαλούνται μετά την ακυλίωσή τους με αρωματικά οξέα [7, 8]. Αυτή η ιδιότητα των φλαβονοειδών φαίνεται να είναι υπεύθυνη για ορισμένες φυσιολογικές λειτουργίες των ανωτέρων φυτών όπως αντίσταση στην υπεριώδη ακτινοβολία και δέσμευση ελευθέρων ριζών.

Βιοκαταλυτικές μέθοδοι για την τροποποίηση των φλαβονοειδών
Συνεχώς αυξανόμενο είναι το ενδιαφέρον για την εισαγωγή αντιοξειδωτικών ενώσεων φυτικής προέλευσης (φλαβονοειδή και φαινολικές ενώσεις), αφενός στη διατροφή, αφετέρου σε φαρμακευτικά σκευάσματα που χρησιμοποιούνται σε ευρεία κλίμακα [9]. Το ενδιαφέρον αυτό είναι αποτέλεσμα των ενδείξεων για τις ευεργετικές ιδιότητες των φυσικών αυτών αντιοξειδωτικών στην πρόληψη ασθενειών όπως ο καρκίνος και βέβαια τα καρδιαγγειακά νοσήματα [10, 11]. Από την άλλη μεριά, συνεχώς αυξανόμενος είναι ο αριθμός αναφορών στη διεθνή επιστημονική βιβλιογραφία που επισημαίνουν την πιθανή τοξικότητα των συνθετικών φαινολικών αντιοξειδωτικών (εστέρες των γαλλικού οξέος, BHA, BHT, BHQ) που χρησιμοποιούνται σήμερα ευρέως στη βιομηχανία τροφίμων, γεγονός που υπογραμμίζει την ανάγκη για την αντικατάσταση των συνθετικών αντιοξειδωτικών με φυσικά. Για να καταστεί εφικτή η ευρεία χρησιμοποίηση των φυσικών αντιοξειδωτικών σε τρόφιμα και φαρμακευτικά σκευάσματα θα πρέπει να επιλυθεί το πρόβλημα της διαλυτοποίησης των ενώσεων αυτών κυρίως σε λιπόφιλα συστήματα (έλαια, λίπη, γαλακτώματα κ.λ.π) [12]. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί μέσω της τροποποίησης τους προς τα αντίστοιχα λιπόφιλα παράγωγά τους. Η παρασκευή λιπόφιλων παραγώγων μπορεί να επιτευχθεί μέσω της εκλεκτικής ακυλίωσής τους με λιπαρά οξέα. Μέχρι σήμερα, η κλασική χημική μεθοδολογία που αφορά στην παρασκευή των παραγώγων των φυσικών προϊόντων συχνά δεν καλύπτεται από τους κανονισμούς τροφίμων της Ε.Ε., καθώς προϋποθέτει τη χρήση τοξικών καταλυτών και διαλυτών αλλά και την εφαρμογή υψηλών θερμοκρασιών και, επομένως, η χημική τροποποίηση τέτοιων ενώσεων δεν μπορεί να εφαρμοστεί στη βιομηχανία τροφίμων. Η εφαρμογή κλασικών χημικών μεθόδων χαρακτηρίζεται συχνά από μειωμένη εκλεκτικότητα γεγονός που οδηγεί στην εμφάνιση ανεπιθύμητων παραπροϊόντων καθώς και στην απώλεια της αντιοξειδωτικής δράσης του τελικού προϊόντος. Σε αντίθεση με την κλασική προσέγγιση, η ανάπτυξη των βιοκαταλυτικών μεθόδων αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική λύση, που μπορεί να ικανοποιήσει τα κριτήρια της Ε.Ε. για την ασφάλεια και την ποιότητα των διεργασιών και των προϊόντων, την προστασία της ανθρώπινης υγείας και του περιβάλλοντος [13-14]. Στη βιβλιογραφία παρουσιάζονται αποτελέσματα που αφορούν στην ανάπτυξη βιοτεχνολογικών διεργασιών με σκοπό την αύξηση του λιπόφιλου χαρακτήρα φλαβονοειδών φυτικής προέλευσης με στόχο την αύξηση της αποτελεσματικότητάς τους σε διαδικασίες που αφορούν τη σταθεροποίηση λιπών και ελαίων ή ακόμα την αύξηση της έκφραση της αντιοξειδωτικής τους δράσης στο εσωτερικό του κυττάρου.

Ενζυμική παρασκευή υδρόφοβων παραγώγων των φλαβονοειδών
Διάφορα υδρολυτικά ένζυμα και κυρίως πρωτεάσες και λιπάσες έχουν χρησιμοποιηθεί για την εκλεκτική ακυλίωση των σακχάρων των γλυκοζυλιωμένων φλαβονοειδών, όπως η ρουτίνη, η κερκετίνη, η κερσιτρίνη, και η ισοκερσιτρίνη (Σχήμα 2).
Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η περίπτωση της λιπάσης από Candida antarctica (CAB), η οποία έχει χρησιμοποιηθεί για την τοπο-εκελκτική ακυλίωση πολλών φυσικών γλυκοζιτών και φλαβονοειδών [15]. Συγκεκριμένα, το ένζυμο αυτό επιδεικνύει κατά την επίτευξη αντιδράσεων ακυλίωσης των σακχάρων με λιπαρά οξέα ή εστέρες λιπαρών οξέων, μεγάλη εκλεκτικότητα ως προς τα πρωτοταγή υδροξύλια των σακχάρων [16].
Στο Σχήμα 3 φαίνεται η εκλεκτική ακυλίωση της κερκετίνης που καταλύει η λιπάση από Candida antarctica σε τριτοταγή βουτανόλη [16].
Όπως έχει ήδη διαπιστωθεί, η δράση των φλαβονοειδών ως παρεμποδιστές ενζύμων και δεσμευτές ριζών, εξαρτάται αυστηρά από την θέση των οξυγονούχων ομάδων σε συγκεκριμένες θέσεις στο δομικό σκελετό της φλαβάνης [17]. Συνεπώς, η παρασκευή συγκεκριμένων τοποπροστατευμένων παραγώγων των φλαβονοειδών προσελκύει το ενδιαφέρον τόσο της κλασσικής οργανικής σύνθεσης όσο και της βιοτεχνολογίας και συγκεκριμένα των βιοκαταλυόμενων μετατροπών. Οι βιοκαταλυτικές μέθοδοι που έχουν αναπτυχθεί τα τελευταία χρόνια στόχευσαν στην παρασκευή εστέρων των φλαβονοειδών, όπως για παράδειγμα της κερκετίνης και της κατεχίνης [16, 18]. Ενδεικτικά αναφέρεται το παράδειγμα όπου ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε το αντίστοιχο πεντα-ακέτυλο παράγωγο 2, λόγω της χαμηλής διαλυτότητας της κερκετίνης σε κοινούς οργανικούς διαλύτες, το οποίο υποβλήθηκε σε αλκοολόλυση παρουσία της λιπάσης από Candida antarctica (CAL) και Mucor miehei (MML). Η (CAL) αναγνωρίζει επιλεκτικά την εστερομάδα στον άνθρακα στη θέση 3΄ και 4΄ και, κατά συνέπεια, καταλύει την αλκοολόλυσή του δίνοντας τον τριεστέρα 3. Αντίθετα. η (MML) δείχνει προτίμηση στην ακέτυλο ομάδα του Α δακτυλίου, οπότε προκύπτει ο τετραεστέρας 4, ενώ αυξάνοντας το χρόνο επώασης της αντίδρασης υδρολύονται και οι εστερομάδες του Β δακτυλίου, δίνοντας τον μονοεστέρα 5 (Σχήμα 4α). Με αντίστοιχο τρόπο, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4β, είναι δυνατή η ενζυμική παρασκευή λιπόφιλων παραγόγων της κατεχίνης (7 α-ζ), τα οποία διαθέτουν ελεύθερα φαινολικά υδροξύλια διαθέσιμα για τη δέσμευση ριζών, ενώ, παράλληλα τα υδρόφοβα αυτά παράγωγα (σε σχέση με τα μητρικά φλαβονοειδή), είναι δυνατόν να παρουσιάζουν τροποποιημένες φαρμακοκινητικές ιδιότητες, όταν εφαρμόζονται για παράδειγμα σε σκευάσματα που σχετίζονται με δερματικές παθήσεις.
Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η τροποποίηση φυσικών φλαβονοειδών όπως του χρυσοεριολο-7-O-(-D-(3΄΄-E-π-κουμαροϋλο)-γλυκοπυρανοσίδη (ι) και του χρυσοεριολο-7-[6΄΄΄-Ο-ακετυλο-β-D-αλλοσυλο-(1?2)-β-D-γλυκοπυρανοσίδη (ιι) τα οποία απομονώθηκαν από δύο ελληνικά ενδημικά φυτά τον Stachys swainsonii ssp. argolica και Stachys swainsonii ssp. swainsonii, αντίστοιχα. Διαπιστώθηκε ότι η αύξηση του λιπόφιλου χαρακτήρα των φλαβονοειδών, είναι δυνατή μέσω της τοπο-εκλεκτικής εστεροποίησής τους με βινυλεστέρα του λαουρικού οξέος (απόδοση 90%), χρησιμοποιώντας την λιπάση από Candida antarctica (Novozyme) σε άνυδρη τριτοταγή βουτανόλη στους 55oC (Σχήμα 5) [19]. Αξίζει να αναφερθεί ότι στην περίπτωση των φλαβονοειδών (ι) και (ιι) προσδιορίσθηκε η αντιμικροβιακή δράση των φυσικών προϊόντων και των παραγώγων τους έναντι τριών Gram-θετικών και τριών Gram-αρνητικών βακτηρίων Τα εστεροποιημένα προϊόντα έδειξαν μια μεγαλύτερη δραστικότητα έναντι δύο Gram-θετικών βακτηρίων, πιθανόν λόγω της αύξησης του λιπόφιλου χαρακτήρα τους. Παράλληλα, τα εστεροποιημένα προϊόντα επέδειξαν μια αυξημένη αντιοξειδωτική δράση, σε σχέση με τα μη εστεροποιημένα, ως προς την οξείδωση της LDL [19].

Ενζυμική παρασκευή υδρόφιλων παραγώγων φλαβονοειδών.
Τελευταία, αναπτύχθηκε μια νέα βιοτεχνολογική διεργασία για την παρασκευή υδρόφιλων παραγώγων φλαβονοειδών η οποία βασίζεται στη διαλυτοποίηση τους σε υπέρκορα διαλύματα που παρασκευάζονται με δότες γλυκοζίτες, όπως μονο και ολιγοσακχαρίτες και παράγωγα πολυαιθυλενογλυκόλης. Σε τέτοια συστήματα καθίσταται αποτελεσματική η ενζυμική γλυκοζυλίωση φλαβονοειδών όπως η κατεχίνη, που καταλύουν ένζυμα όπως κυτταρινάσες, αμυλάσες, α-D-γλυκοζιδάσες (Σχήμα 6) [18]. Η τοποεκλεκτικότητα της αντίδρασης εξαρτάται τόσο από τη φύση του υποστρώματος όσο και από την εκλεκτικότητα των ενζύμων που θα χρησιμοποιηθούν. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι οι γλυκοζίτες που προκύπτουν μπορούν περαιτέρω να τροποποιηθούν με τοποεκλεκτική ακυλίωση τους με αρυλοπροπενοϊκά οξέα που καταλύεται σε άνυδρα οργανικά συστήματα από ένζυμα όπως η λιπάση από Candida antarctica και σε μικρότερο βαθμό η λιπάση από Mucor miehei.